Polimorfismo genético das metaloproteases da matriz 1 e 3 está associado à rotura do manguito rotador

Estudos de ciência básica sugerem que a degeneração das fibras de colágeno nas roturas do manguito rotador estão associados ao aumento da atividade das metaloproteases da matriz 1 e 3 (MMP-1 e MMP-3), e que a atividade das MMP pode ser, em parte, mediada geneticamente. O grau em que isto pode trazer relevância clínica em pacientes com rotura no manguito rotador ainda não foi bem caracterizado.

Questionamentos / Propósitos

(1) O polimorfismo genético da MMP-1 e da MMP-3 está associado à rotura do manguito rotador? (2) Há haplótipos da MMP-1 e da MMP-3 correlacionados à rotura do manguito rotador? (3) Comparados a indivíduos em um grupo-controle, os pacientes com rotura do manguito rotador apresentam uma maior proporção de parentes com a mesma condição?

Métodos

Avaliamos 64 pacientes com roturas do manguito rotador de espessura total e 64 indivíduos assintomáticos de um grupo-controle. Foram incluídos pacientes com menos de 65 anos, e lesões não-traumáticas. O tamanho da lesão ou integridade da rotura do manguito rotador foi avaliada por RM e ultrassonografia em todos os indivíduos. Os pacientes e os indivíduos do grupo-controle foram pareados por idade. Os genótipos MMP-1 e MMP-3 foram determinados através de ensaios acerca do polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição por PCR.

Resultados

O polimorfismo genético das MMP-1 e MMP-3 está associado com roturas do manguito rotador, de modo que indivíduos com  genótipos 1G/2G (pacientes, 32 de 64 [50%], indivíduos do grupo-controle, 16 de 64 [25%]; razão de probabilidade [RP], 4.8; 95% IC, 2.1–11.0; p < 0.001) e 2G/2G estavam em maior risco para uma rotura do manguito rotador (pacientes 15 of 64 [23%], indivíduos no grupo-controle, 7 de 64 [11%]; RP, 5.2; 95% IC,1.8–14.9; p < 0.001), e pacientes com rotura no manguito rotador estavam associados à maior proporção de alelos 2G (62 de 128 [48%] x 30 de 128 [23%]; p < 0.001).

Pacientes com genótipo 5A/5A estão em maior risco de sofrer uma rotura do manguito rotador (pacientes, 15 de 64 [23%]; sujeitos controle, 4 de 64 [6%]; RP, 5.5; 95% IC, 1.4–20.9; p = 0,021), e houve maior distribuição dos alelos 5A em pacientes com roturas do manguito rotador (pacientes, 68 de 128 [53%]; indivíduos do grupo-controle, 52 de 128 [41%]; p = 0.045). Indivíduos com o haplótipo 2G/5A eram mais propensos a sofrer roturas do manguito rotador (pacientes, 42 de 64 [66%]; indivíduos do grupo-controle, 17 de 64 [27%]; RP 5.3; IC 95%, de 2,5 11.3; p < 0.001). Pacientes com roturas do manguito rotador declararam, em maior número, a existência de parentes que já haviam passado por tratamento para lesões do manguito rotador (19 de 64 [30%] x 4 de 64 [6%]; RP, 6.3; 95% IC, 2.0-19.9; p = 0,001).

Conclusões

O polimorfismo genético da MMP-1 e da MMP-3 está associado a rotura do rotador. Os indivíduos com haplótipo 2G/5A mostraram-se mais suscetíveis a sofrer rotura do manguito rotador na população estudada.

Relevância Clínica

Conhecer os marcadores genéticos relacionados à lesões no manguito rotador pode permitir a identificação de indivíduos suscetíveis, e aumentar a compreensão da patogênese da degeneração dos tendões.

Introdução

A degeneração dos tendões é mediada por metaloproteases da matriz (MMPs), citocinas e radicais livres que atuam na matriz extracelular, alterando sua composição e propriedades biomecânicas [22]. As MMPs são enzimas capazes de degradar fibras de colágeno e outros elementos da matriz extracelular [9].

A MMP-1 é uma protease que decompõe fibras colágenas do tipo I [28]. A MMP-3 está envolvida na regulação e ativação das MMPs. Para além desta atividade, a MMP-3 é capaz de degradar os colágenos de tipo II, IV, V, IX e X, proteoglicanos, fibronectina e elastina [11]. A produção e ativação das MMPs são induzidas pelas citocinas, fatores de crescimento e interações célula-célula e célula-matriz celular [9]. Alguns polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) na região promotora do gene MMP estão correlacionados com um aumento da atividade e produção destas enzimas [25, 33]. Os SNPs da MMP-1 e da MMP-3 já foram correlacionados com a tendinopatia do tendão tibial posterior e do tendão de Aquiles [12, 31].

A etiologia de uma rotura do manguito rotador é um processo multifatorial, e vários fatores extrínsecos e intrínsecos ao tendão foram propostos para explicá-la [20]. Não há consenso sobre os principais fatores, e parece haver interação entre eles [7, 22]. Os fatores extrínsecos incluem pinçamentos ósseos e variações morfológicas no arco coracoacromial, tais como um acrômio curvo ou ganchoso e os acromiale [22].

Os fatores intrínsecos incluem degeneração dos tendões, hipovascularização dos tecidos e respostas inflamatórias locais [22, 41]. Na patogênese de uma rotura do manguito rotador, encontramos uma diminuição na síntese e um aumento na degradação das fibras de colágeno associados a um aumento na atividade de MMP-1 e MMP-3 [6, 13, 27, 40].

Há evidências de que fatores genéticos podem estar envolvidos na etiologia das roturas do manguito rotador [16, 36]. Há pouco tempo, alguns SNPs foram associados a tendinopatia ou rotura do manguito rotador. [17, 24, 37, 38]. No entanto, não encontramos estudos que avaliem, de forma exclusiva, a associação do polimorfismo genético das MMPs e as roturas nos manguito rotador, apesar da relevância destas enzimas em sua fisiopatologia.

Portanto, questionamos: (1) O polimorfismo genético da MMP-1 e da MMP-3 está associado à rotura do manguito rotador? (2) Há haplótipos da MMP-1 e da MMP-3 correlacionados à rotura do manguito rotador? (3) Comparados a indivíduos em um grupo-controle, os pacientes com rotura do manguito rotador apresentam uma maior proporção de parentes com a mesma condição?

Materiais e métodos

Realizamos um estudo de casos-controle com razão de um para um. Avaliamos pacientes com menos de 65 anos que foram submetidos ao reparo de rotura de espessura total no manguito rotador em nossa instituição entre junho de 2014 e dezembro de 2015. Foram excluídos pacientes com doenças reumatológicas, diabetes, cirurgias no ombro prévias ou processos infecciosos anteriores ou atuais no ombro afetado. Pacientes com roturas traumáticas também foram excluídos, assim como aqueles com roturas parciais.

O grupo-controle consistiu de pacientes que foram tratados no mesmo hospital para afecções traumáticas sem sintomas de dor no ombro e sinais clínicos de patologia no manguito rotador. Os pacientes e os indivíduos no grupo-controle foram pareados por idade, com uma diferença máxima de ± 2 anos. Os pacientes e os indivíduos no grupo-controle foram submetidos a exames de imagem do manguito rotador (RM ou ultrassonografia). Todos os indivíduos no grupo-controle tinham tendões do manguito rotador intactos. Os pacientes com rotura do manguito rotador foram avaliados por ressonância magnética. Entre os indivíduos no grupo-controle, 30 de 64 (47%) foram submetidos a ultrassonografia para avaliar a integridade do manguito rotador, e a RM foi o método de obtenção de imagens utilizado em 34 de 64 (53%). Os exames foram realizados no departamento de radiologia da nossa instituição por um mesmo grupo de radiologistas musculoesqueléticos (APB, COK, MBR).

O estudo foi aprovado pelo Comitê de ética local. Obtivemos, de todos os pacientes, consentimento informado e, mais para frente através de entrevista obtivemos os seguintes dados: idade, sexo, raça, tabagismo, presença de pressão alta, hipotiroidismo, tendinopatias em outras articulações, existência de parentes que já haviam sido submetidos à tratamento para rotura do manguito rotador, prática de esportes que envolvem o ombro, e trabalho com abdução do braço repetitiva e constante. Avaliamos 128 pacientes, 64 com rotura do manguito rotador e 64 indivíduos no grupo-controle (Tabela 1).

Não houve perda de amostra durante a extração e genotipagem do DNA. Os pacientes com rotura do manguito rotador e os indivíduos do grupo-controle tiveram uma média de idade de 54 ± 6 anos e 53 ± 6 anos, respectivamente (p = 0, 586). Dos pacientes que foram submetidos ao reparo do manguito rotador, 44 (69%) foram do sexo feminino, e dos indivíduos do grupo-controle, 40 (61%) foram do sexo feminino (p = 0, 577).

Os grupos não diferiram em relação à raça, tabagismo, ou a presença de pressão arterial elevada (p = 0.692, p > 0.999, e p = 0.831, respectivamente). As tendinopatias em outras articulações foram mais prevalentes entre os pacientes com rotura no manguito rotador (p = 0.016).

O DNA de células epiteliais bucais foi extraído através do procedimento descrito por Aidar e Line [2]. A concentração de DNA (ng/µL) foi estimada por medições de densidade óptica de 260/280 nm a uma razão superior a 1.9.

Os SNPs foram previamente identificados e incluídos na base de dados do Centro Nacional de informação em Biotecnologia (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/) com menores frequências alélicas superiores a 0.2. Os genótipos MMP foram determinados através de ensaios acerca de polimorfismo no comprimento de fragmentos aleatórios por PCR (Tabela 2).

Os iniciadores PCR foram obtidos em um volume total de 15 µL contendo 100 ng de DNA genômico, 8 µL Taq Verde (Amersham Pharmacia-Biotech, Uppsala, Suécia), e 200 nmol de cada iniciador. Uma alíquota de 8-µL de produtos PCR foi então digerida com 1 unidade de enzima específica de um dia para o outro. A quantidade total de alíquota digerida passou por eletroforese em 5% de agarose a 20 mA. O gel foi fixado por GelRed^TM (Biotium Inc, Fremont, CA, EUA).

O polimorfismo da MMP-1 na posição-1607 (rs1799750) é caracterizado pela inserção de uma guanina (G), O que resulta em dois alelos: 1G e 2G. O alelo 2G é representado pelo DNA de 118 pares de bases e o alelo 1G é representado pelo DNA de 89 pares de bases. O genótipo heterozigótico tem uma combinação de ambos os alelos.

O polimorfismo da MMP-3 (rs3025058) é caracterizado pela presença de cinco ou seis adeninas na posição -1612, resultando em alelos 5A e 6A. O alelo 6A é representado por uma fita de DNA com 129 pares de base e o alelo 5A por 97 pares de base. O genótipo heterozigótico tem uma combinação de ambos os alelos.

O cálculo do tamanho da amostra utilizou um nível de significância de 5% e potência de 80%. Na época em que este protocolo de pesquisa foi elaborado, não havia estudos, tanto quanto sabemos, sobre a associação entre o polimorfismo genético de MMPs e as roturas do manguito rotador. Utilizando uma taxa de 25% do alelo 2G da MMP-1 no grupo-controle [12], uma diferença esperada de 25% entre os grupos e uma perda de 10% de amostras na extração e genotipagem do DNA, foram necessários 64 indivíduos para cada grupo.

Análise estatística

A normalidade dos dados foi testada através do teste de Shapiro-Wilk. Todas as variáveis contínuas foram distribuídas de forma normal. As variáveis contínuas foram apresentadas como desvios médio e padrão e as variáveis de natureza categórica como valores absolutos e percentuais.

A comparação entre os pacientes e os indivíduos do grupo-controle, em relação às diferentes variáveis, foi realizada atrevés do teste exato de Fisher ou do teste de χ2 nas variáveis categóricas e teste t de Student para as variáveis contínuas.

A diferença na frequência dos alelos e genótipos das MMP-1 e -3 foi avaliada em pacientes com roturas do manguito rotador e nos indivíduos do grupo controle por meio do teste de χ2. A probabilidade da associação com roturas do manguito rotador foi calculada como razão de probabilidade (RP) para os diferentes genótipos com um intervalo de confiança de 95%.

O programa ARLEQUIN versão 2.0 (Laurent Excoffier CMPG, Instituto de Ecologia e evolução, Universidade de Berna, Berna, Suíça) [34] foi utilizado para a análise do equilíbrio Hardy-Weinberg na população estudada. A distribuição de genótipos dos indivíduos do estudo estava dentro do equilíbrio de Hardy-Weinberg. Para a análise de dados, usamos SPSS^® Versão 21.0 (IBM Corp, Armonk, NY, EUA) com um nível de significância de 5%.

Resultados

O polimorfismo genético na MMP-1 e na MMP-3 está associado com roturas do manguito rotador, em que indivíduos com rotura do manguito rotador possuem genótipos associados 1G/2G (pacientes, 32 de 64 [50%], indivíduos do grupo-controle, 16 de 64 [25%]; razão de probabilidade [RP], 4.8; 95% IC, 2.1–11.0; p < 0.001) e 2G/2G estavam em maior risco (pacientes 15 of 64 [23%], sujeitos controle, 7 de 64 [11%]; RP, 5.2; 95% IC,1.8–14.9; p < 0.001), e pacientes com rotura no manguito rotador estavam associados à maior proporção de de distribuição de alelos 2G (62 de 128 [48%] x 30 de 128 [23%]; p < 0.001) (Tabela 4). Pacientes com genótipo 5A/5A estão em maior risco de sofrerem uma rotura do manguito rotador (pacientes, 15 de 64 [23%]; indivíduos no grupo-controle, 4 de 64 [6%]; RP, 5.5; 95% IC, 1.4–20.9; p = 0,021), e houve maior distribuição dos alelos 5A em pacientes com roturas do manguito rotador (pacientes, 68 de 128 [53%]; indivíduos do grupo-controle, 52 de 128 [41%]; p = 0.045). Os indivíduos com o haplótipo 2G/5A mostraram maior probabilidade de desenvolver rotura do manguito rotador: (pacientes, 42 de 64 [66%]; indivíduos do grupo-controle, 17 de 64 [27%]; RP, 5.3; IC 95%, 2.5-11.3; p < 0.001) (Tabela 3).

Pacientes com roturas do manguito rotador declararam, em maior número, a existência de parentes que já haviam passado por tratamento para lesões do manguito rotador (19 de 64 [30%] x 4 de 64 [6%]; RP, 6.3; 95% IC, 2.0-19.9; p = 0,001).

Discussão

A tendinopatia do manguito rotador é a principal causa de dor no ombro [23] sendo que a ruptura destes tendões ocorre em 20% da população [43]. A fisiopatologia das roturas no manguito rotador é um processo multifatorial e há evidência de que fatores genéticos podem estar envolvidos na etiologia das roturas do manguito rotador[17, 24, 37, 38]. É provável que um certo número de genes possa estar envolvido no desenvolvimento de uma rotura no manguito rotador, cada um com uma pequena contribuição.

Interações complexas ocorrem entre as proteínas, codificadas por múltiplos genes, e o ambiente no desenvolvimento destas lesões [35]. Semelhante aos resultados de estudos que avaliaram pacientes com tendinopatias nos membros inferiores [12, 31], o polimorfismo genético da MMP-1 e a MMP-3 está associado a roturas no manguito rotador.

O nosso estudo tem algumas limitações. Para um estudo genético, a amostra com 128 indivíduos avaliados pode ser considerada pequena. Estudos com amostras maiores, ou em outras populações, devem ser realizados para confirmar a associação destes polimorfismos com as roturas do manguito rotador. Há uma falta de padronização nos exames de imagem usados para confirmar a integridade do manguito rotador em indivíduos assintomáticos; Ressonância magnética ou ultrassonografia foram usadas na avaliação.

No entanto, apenas Kluger et al. [17] obtiveram imagens do manguito rotador para confirmar a integridade do tendão em indivíduos assintomáticos de um grupo-controle, e até 60% dos pacientes com rotura do manguito rotador podem ser assintomáticos [42]. Também podemos afirmar que a ultrassonografia possui sensibilidade e especificidade semelhantes na essonância magnética em vários estudos [8, 19, 32].

Não avaliamos os fatores de risco de rotura do manguito rotador como IMC [15] e braço dominante [31]. Os fatores que não foram avaliados poderiam atuar como fatores de confusão em nossa análise. No entanto, conhecidos fatores de risco para lesões do manguito rotador, tais como a idade, [39], sexo [32], tabagismo [4], etnia caucasiana [17], presença de hipertensão arterial sistêmica [14], hipotiroidismo [26], atividade profissional com esforços repetitivos dos ombros [5], e esportes com o uso dos membros superiores [29], não diferem entre os dois que estudamos, o que demonstra que os critérios para a obtenção da amostra foram satisfatórios.

Realizamos entrevistas para coletar dados acerca da existência de parentes que passaram por tratamento para rotura do manguito rotador e presença de tendinopatias em outras articulações. Os pacientes com rotura no manguito rotador devem, em tese, ter melhores informações acerca de suas afecções ortopédicas pessoais e familiares, levando a um viés de memória. Como a informação foi relatada pelo paciente, os diagnósticos também podem ser imprecisos. Tal fato pode ter aumentado a associação entre estes fatores de risco e as roturas no manguito rotador.

O nosso estudo mostrou que os polimorfismos genéticos da MMP-1 (rs1799750) e da MMP-3 (rs3025058) estão associados a roturas no manguito rotador. Os genótipos 1G/ 2G ou 2G/2G na posição-1607 do gene MMP-1 foram fatores de risco para o desenvolvimento de roturas no manguito rotador em relação aos indivíduos com genótipo 1G/1G. Os indivíduos com genótipo 5A/5A na posição -1612 do gene MMP-3 eram mais susceptíveis à rotura no manguito rotador. O alelo 2G do polimorfismo da MMP-1 na posição-1607 (rs1799750) aumenta a atividade transcricional do gene [33]. Esta descoberta fornece uma base molecular para a degradação das fibras de colágeno e para o aumento da atividade MMP-1 encontrada em estudos histopatológicos anteriores de pacientes com roturas no manguito rotador [6, 13, 18, 27, 40].

O alelo 5A do MMP-3 (rs3025058) aumenta a transcrição deste gene [44], e alguns estudos anteriores relataram uma maior produção de MMP-3 em pacientes com rotura no manguito rotador em relação a pacientes assintomáticos [1, 6, 27]. No entanto, a atividade transcricional dos genes da MMP não está associada apenas aos polimorfismos do nucleotideo único na região promotora. A produção inicial de MMPs é baixa e a síntese é induzida pelas citocinas, tais como a interleucina-1 e o fator de necrose tumoral, os fatores de crescimento e as interações célula-célula e matriz-célula [9].

Ao contrário do nosso estudo, Kluger et al. [17], não encontraram diferenças na distribuição dos alelos e genótipos MMP-1 e MMP-3. No caso da MMP-1, o polimorfismo estudado foi o rs17884110, diferente do avaliado por nós. Em relação à MMP-3, no entanto, o polimorfismo avaliado foi o mesmo (rs3025058). A falta de acordo entre os resultados pode ser explicada pelo menor número de indivíduos avaliados, pelo não pareamento entre pacientes e indivíduos do grupo-controle por idade e fatores de risco conhecidos, tais como pressão arterial elevada e características genéticas e raciais da população.

Alguns grupos de polimorfismos genéticos em loci adjacente no mesmo cromossomo podem ser herdados em combinação; eles são chamados de haplótipos. Os polimorfismos genéticos podem agir de forma sinergética, o que aumenta o risco de desenvolvimento de alterações tendinosas [30]. A MMP-1 1G/2G e a MMP-3 5A/6A SNPs estão localizados no cromossomo11q22.3 e há um forte desequilíbrio acerca da ligação entre estes dois genes [21]. Os indivíduos com o haplótipo 2G/5A apresentaram maior probabilidade de desenvolver rotura do manguito rotador:

Os estudos iniciais mostraram que os familiares de indivíduos com rotura do manguito rotador apresentam maior risco de desenvolver a mesma condição.[16, 36]. Harvie et al. [16] relataram que os irmãos de pacientes com rotura de espessura total no manguito rotador apresentaram um risco relativo de 2.42 (95% IC, 1.77-3.31) de ter essas roturas em comparação ao grupo-controle. Tashjian et al. [36] avaliaram a predisposição genética para roturas do manguito rotador usando a base de dados da população de Utah. Eles observaram que parentes, de segunda ou terceira geração de pacientes com essas lesões, com menos de 40 anos eram mais propensos a sofrer a mesma lesão. Encontramos uma proporção muito maior da presença de histórico familiar de tratamento para roturas no manguito rotador no grupo de pacientes do que no de indivíduos no grupo-controle. Estas descobertas sugerem uma predisposição familiar e genética para as roturas de manguito rotador. No entanto, o viés de memória pode ter influenciado esta descoberta, e futuros estudos de coorte podem avaliar esta associação de maneira mais extensiva.

Conhecer os marcadores genéticos relacionados com as lesões no manguito rotador pode permitir a identificação de indivíduos suscetíveis, e aumentar a compreensão da patogênese da degeneração dos tendões. Estudos experimentais demonstraram que a utilização de moduladores ou inibidores da atividade da MMP pode influenciar a cicatrização dos tecidos após a reparação do manguito rotador [3, 10].

No futuro, a investigação de outros marcadores genéticos poderia definir e padronizar todos os genes de risco para esta doença, e, assim, criar condições adequadas para o desenvolvimento individualizado de estratégias terapêuticas e preventivas tais como o uso de inibidores de MMP em pacientes suscetíveis a lesões do manguito rotador ou aos que foram submetidos a reparação das lesões, para aumentar a probabilidade de cicatrização e resistência do tendão.

O polimorfismo genético da MMP-1 e da MMP-3 está associado a rotura do manguito rotador. Os indivíduos com haplótipo 2G/5A eram mais susceptíveis a roturas do manguito rotador na população estudada, e os pacientes com esta lesão têm uma maior proporção de parentes com a mesma doença em comparação com os indivíduos do grupo-controle.

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